同类种子中蛋白质的测定

一、染料结合-DBC法

方法原理

蛋白质中的碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸和组氨酸）的-NH、咪唑基和胍基以及蛋白质末端自由氨基在pH=2～3的酸性缓冲液体系中呈阳离子状态存在，可以和偶氮磺酸染料类物质如橘黄G、酸性橙12#等的阴离子结合，形成不溶于水的蛋白质一染料络合物而沉淀下来，通过测定一定量样品与一定量体积的已知浓度染料溶液反应前后溶液中染料浓度的变化，可计算出样品的染料结合量，即每克样品所结合的染料的毫克数。染料结合量的大小反映出样品中碱性氨基酸的多少。在小麦、大麦、水稻、大豆、花生等种子中蛋白质的含量与碱性氨基酸的含量之间有很好的相关性。因此，可以用染料结合量来评比同种作物种子大量原始材料之间蛋白质含量的高低。

如果要从柴料结合量来计算样品的粗蛋白质的含量，则需用开氏法测定同类种子的一批样品的粗蛋白质的质量分数，同时也用染料结合法测定其染料结合量，然后求出粗蛋白质含量（%）对染料结合量的回归方程或绘出回归曲线。这样，测定未知样品的染料结合量，就可以从回归方程计算或查回归线得到粗蛋白质（%）含量。若只需比较蛋白质含量的高低，如在筛选同种作物种子的大批样品时，不必知道蛋白质的绝对含量，只要测定样品的染料结合量即可进行比较。

该法是间接测定种子中蛋白质的方法。方法简单、快速，与开氏法的相关性较好，但准确性较差，适用于大批样品的筛选工作。美国谷物化学协会将该法列为分析小麦蛋白质含量的正式方法（AACC11-2-72）。现已有据此方法原理而设计的蛋白质分析仪。这里必须指出该法对随意混合物的样品不适用。

主要仪器：万分之一天平、水平振荡器、离心机、GXD-型蛋白质分析仪或型分光光度计。

试剂

染料溶液（ED）。称取柠檬酸（C6H8O7·H2O，分析纯）20.70g和Na2HPOH2O（分析纯）1.44g溶于~mL水，全部转入mL容量瓶中。另外准确称取橘黄G（C16H10O7N2S2Na2，分子量.38）1.g，加少量水在80℃水浴上溶解，无损地转入上述容量瓶中，再加入g·L-1百里酚酒精溶液3~5滴以防腐，定容。此溶液为1.g·L~l染料溶液。

操作步骤

（1）标准曲线制作。与样品测定的同时，取1.g·L-

的染料溶液10、30、50、60、70、80mL放入mL容量瓶中，用水定容，即得浓度系列为0.1、0.3、0.5、0.6、0.7、0.8g·L的染料标准溶液，用GXD-型蛋白质分析仪测透光率（T），并用半对数坐标纸上绘制浓度——透光率（T）值的标准曲线。如无该型号的蛋白质分析仪，也可以把残余的染料溶液用水稀释50倍后，用0.5cm比色杯和mm的波长，在分光光度上测定吸收值（A）绘制标准曲线。

（2）样品的测定。称取通过0.25mm筛子的谷物样品（*2）～mg，放人30mL试管中，加入1mgmL-2染料溶液20mL，盖紧试管口，在水平振荡器上振荡60min，使样品和染料溶液充分反应（*），取反应后的浑浊液（8～10mL）注入离心管中，以0r/min的速度离心8~12min，至上部溶液澄清为止，以下操作步骤同标准曲线。

（3）回归方程。选取粗蛋白质含量从低到高（如小麦种子粗蛋白质含量可以从7.0%～17.0%）的同一类谷物样品35个左右，用开氏法测其粗蛋白质含量（%），并用上述方法测定各样品的染料结合量。根据所得的结果，计算出染料结合量（mg·gl）与蛋白质含量（%）之间的回归方程。

结果计算样品的染料结合量计算公式如下∶

样品的蛋白质含量（%）。将样品的DBC值（即“B”值）代人回归方程，计算样品蛋白质的含量。

注释

注1.在偶氮磺酸染料中，除橘黄G外，也可以使用酸性12*（AcidOrange12"，缩写AO12，C16H11O4N2SNa，分子量.37），它的分子结构与橘黄G基本相同，也含有一个偶氮发色基团，但只有一个磺酸基，即一个结合碱基的位置（橘黄G二个），后者每个碱基结合点引起的颜色变化约是橘黄G的2倍。故其更适合于在染料结合法中应用，它们在nm左右有一个较宽的吸收峰，便于比色测定。

注2.样品称样量按蛋白质含量的高低而定。水稻、小麦、大麦等可称取mg，玉米称取mg，大豆称取mg，花生及鱼粉等可少一些。

注3.染料结合反应的条件，如染料的pH、样品的粒度、振荡反应的时间和温度等影响到测定的结果，故应力求每次测定的反应条件一致，特别是测定样品与测定回归方程的样品时的反应条件一致。

二、双缩脲法

方法原理

蛋白质的肽键（

）结构，具有类似于双缩脲的反应基团。在碱性条件下能与Cu2+生成紫红色可溶性络合物，蛋白质含肽键多时反应呈紫色，反之肽键少时，反应呈红色。这种颜色反应称为双缩脲反应（或称缩二脲反应）。实验证明，蛋白质溶液浓度在1～15mg之间，其呈色溶液的吸收值与蛋白质含量成正比关系。故可用此反应进行蛋白质的测定。

本法须用开氏法作标准回归方程。经试验其与开氏法的相关性较好，适用样品广泛，如小麦、大麦、水稻、玉米和高粱等蛋白质的测定，皆能获得良好的效果，且方法快速，使用仪器设备简单，尤适用于大批品种选择用（注D。

主要仪器：恒温水浴锅、离心机、型分光光度计。

试剂

双缩脲试剂。在mL容量瓶中依次加入下列溶液，40g·LCuSOmL，25g·L-酒石酸钾钠mL，再缓慢加入5mol·L=1KOH30mL，用去离子水定容。使用时将此溶液与等体积透明的异丙醇混合。若溶液中出现浑浊或沉淀，则不宜使用（生2）。

操作步骤

（1）样品的测定。准确称取过60目筛的样品0.～0.g（含蛋白质在1～15g·L-2范围内），放入干燥试管中，再用移液管加入10mL双缩脲试剂，充分搅拌，于40℃水浴放置15min/*3），并经常搅拌。然后过滤或用0r*min二离心10min（*+），取清液用mm波长比色，从标准回归方程查得蛋白质含量。

（2）标准回归方程的测定。分别称取0.0~0.1g待测定谷物样品20～30个（也可用蛋白质含量差异大的样品30个左右），先用开氏法测出其蛋白质的含量，然后按上法显色并测定吸收值A，作出标准回归方程。

结果计算

蛋白质（%）=回归方程计算得蛋白质含量（g）×/样品质量（g）

注释

注1.该法为美国谷物化学协会（AACC）测定谷物蛋白质的正式方法，且已有据此法原理为基础的快速测定蛋白质的自动分析仪。

注2.一般的生化分析中采用的双缩脲试剂是碱性硫酸铜水溶液，不适用于种子蛋白质的分析，因为它不稳定，而且会浸出有色物质、脂肪及一些淀粉物质，干扰比色测定。而异丙醇双缩脲试剂，可以减少这些物质的溶解，排除干扰。对一些颜色较深的种子测定，则应先以四氯化碳处理已称好的样品，并用10g·L-HO2降解有色物质，然后再加入双缩脲试剂，以消除对测定结果的影响。

注3.本法对温度及时间的要求严格，否则再现性不高。采用室温20～25℃，须于～min内比色；40℃为15～70min显色稳定；而在60℃连续振荡条件下显色，则反应时间缩短为5min。

注4.离心须用6r-min，10min可得澄清液，小于0r，min-l的效果不佳。