GB50092112022英文版食品

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GB.-英文版食品安全国家标准食品中叶酸的测定

提供更多标准英文版。

1范围

本标准规定了食品中叶酸的测定方法。

本标准适用于食品中叶酸的测定。

2原理

叶酸是鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)生长所必需的营养素。在一定控制条件下,将鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有试样液的培养基中,培养一段时间后测定透光率(或吸光度值),在一定测定范围内可以根据叶酸含量与透光率(或吸光度值)的标准曲线计算出试样中叶酸的含量。

3试剂和材料

除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T规定的二级水。

3.1试剂

3.1.1盐酸(HCI)。

3.1.2

氢氧化钠(NaOH).

3.1.3.

氯化钠(NaC).

3.1.4十二水合磷酸钠(NasPO,●12H2O).

3.1.5七水合磷酸氢二钠(Na2HPO,●7H2O)。

3.1.6L-抗坏血酸(C。HsO。)。

3.1.7

甲苯(C,H)。

3.1.8无水乙醇(C2H,O).

3.1.9

鸡胰腺冻干粉:含y-谷胺酰基水解酶。

3.1.10木瓜蛋白酶:酶活≥5U/mg.

3.1.11a-淀粉酶:酶活力≥1.5U/mg.

3.2试剂配制

3.2.1磷酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH6.8):分别称取4.35g十二水合磷酸钠和10.39g七水合磷酸氢二钠,加水溶解并定容至1L,混匀。加入2mL甲苯,室温保存。临用前按约5mg/mL的比例加入L-抗坏血酸作为叶酸保护剂,调节pH至6.8士0.1.

3.2.%乙醇溶液(2+8):量取mL无水乙醇与mL水混匀。

3.2.3氢氧化钠乙醇溶液(0.01mol/L):称取0.4g氢氧化钠，用20%乙醇溶液溶解并定容至1L,混匀。

3.2.4氢氧化钠溶液(1mol/L):称取40g氢氧化钠,加水溶解并定容至1L,混匀。

3.3培养基

3.3.1菌种储备用琼脂培养基:按A.1配制.

3.3.2叶酸测定培养基:按A.2配制。

注:以上培养基也可用商品化的合成或成品培养基,用前按说明书配制。

3.4标准品

叶酸标准品(Ci。HpN,O%,CAS:59-30-3):纯度≥97%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

3.5标准溶液的配制

3.5.1叶酸标准储备液(20.0pg/mL):准确称取20.0mg叶酸标准品，用氢氧化钠乙醇溶液溶解,转移并定容至mL棕色容量瓶中。将溶液转移至棕色玻璃容器中,于2C~4C冰箱避光保存,保存期2年。

3.5.2叶酸标准中间液(0.pg/mL):准确吸取1.00mL叶酸标准储备液置于mL棕色容量瓶中,用氢氧化钠乙醇溶液稀释并定容至刻度,混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器中,于2C~4C冰箱避光保存,保存期1年。

3.5.3叶酸标准工作液(0.ng/mL):准确吸取1.00mL叶酸标准中间液置于0mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度,混匀。现用现配。

4仪器和设备

4.1天平:感量为0.1mg和1mg.

4.2恒温培养箱:36C+1C.

4.3高压灭菌锅。

4.4涡旋振荡器.

4.5离心机:r/min.

4.6

接种环和接种针.

4.7pH计:精度为士0.1.

4.8

组织粉碎机和研磨仪。

4.9紫外-可见分光光度计.

4.10超净工作台。

4.11超声波振荡器。

4.12酶标仪。

4.13离心管.

4.14微孔板(无菌)。

4.15滤膜(0.22pm)。

4.16容量瓶。

5菌种的制备与保存

5.1菌种

鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus(ATCC)或等效菌株.

5.2储备菌种的制备

将菌种鼠李糖乳杆菌转接至菌种储备用琼脂培养基中,在36C士1C恒温培养箱中培养20h~24h,连续传种2代~3代。取出后放人2C~4C冰箱作为储备菌株保存。

实验前将储备菌株接种至菌种储备用琼脂培养基中,在36C士1C恒温培养箱中培养20h~24h以活化菌株,用于接种液的制备。

注:保存2周以上的储备菌种,不能立即用作接种液制备,实验前宜连续传种2代~3代以保证细菌活力。

5.3接种液的制备

实验前一天,取2mL叶酸标准工作液与4mL叶酸测定用培养基混匀,分装至2支试管中,于C(0.10MPa~0.12MPa)高压灭菌15min(或根据培养基标签标识进行灭菌)后即为种子培养液。

冷却后用接种环将活化的菌株转种至2支种子培养液中,于36C士1C恒温培养箱中培养20h~24h.取出后将种子培养液混悬,无菌操作下吸取0.5mL.转种至5mL不加叶酸标准工作液的无菌叶酸测定培养基中,于36C士1C再培养6h,以消耗种子培养液中残存在菌株中的多余叶酸，制成接种液。

6分析步骤(所有操作均需避光进行)

6.1试样制备

谷物类.豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.3mm~0.5mm);肉、蛋.坚果等用均质器制成食糜;果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀,也可采用冷冻干燥粉碎法混匀;液体试样用前振摇混合。上述制备的试样于2C~4C冰箱可保存1周。

6.2试样提取

6.2.1直接提取法

测定样品中添加的叶酸含量时,可采用直接提取法。

准确称取固体试样0.1g~2g或液体试样0.5mL~2mL,精确至0.g,转人锥形瓶中,加入80mL氢氧化钠乙醇溶液,具塞,超声振荡0.5h~4h至试样完全溶解或分散,转入mL容量瓶中，用水定容至刻度.

6.2.2酶解提取法

谷薯类.肉蛋乳类、果蔬菌藻类、豆类及坚果类等食品试样中天然存在的叶酸宜采用酶解提取法准确称取适量试样(含0.2μg~2ug叶酸),精确至0.g。一般谷薯类.肉类、乳类、新鲜果蔬、菌藻类试样2g~5g;蛋类、豆类、坚果类、内脏、干制试样0.2g~2g;流质或半流质试样5g~10g.转入mL锥形瓶中,加30mL磷酸盐缓冲液,振摇5min后,具塞,于C(0.10MPa~0.12MPa)高压水解15min.

6.3稀释

根据试样中叶酸含量用水对试样提取液进行适当稀释,使试样稀释液中叶酸含量在0.2ng/mL~0.3ng/mL范围内。

6.4试样测定

6.4.1试管法

6.4.1.1试样和酶空白系列管

取3支试管,分别加入1.0mL.2.0mL.3.0mL试样稀释液(V,),补水至5.0mL,混匀。另取3支试管同法加人酶空白液。每个梯度做2个平行。

6.4.1.2标准系列管

取试管分别加入叶酸标准工作溶液0.00mL.0.25mL、0.50mL.1.00mL.1.50mL.2.00mL、2.50mL.3.00mL.4.00mL和5.00mL,补水至5.00mL,相当于标准系列管中叶酸含量为0.00ng.0.05ng.0.10ng.0.20ng.0.30ng.0.40ng.0.50ng.0.60ng.0.80ng和1.00ng,混匀。制备2套~3套标准系列管,绘制标准曲线时,以每个标准点平均值计算。

6.4.1.3灭菌

将所有测定系列管、叶酸测定培养基于C(0.10MPa~0.12MPa)高压灭菌15min(或根据培养基要求进行灭菌)。

6.4.1.4接种和培养

待测定系列管冷却至室温后,在无菌操作条件下,每10mL叶酸测定培养基加人接种液40pL,混匀，每支测定管中加人接种后的叶酸测定培养基5mL,混匀。置于36C士1C恒温培养箱中培养20h~40h,获最大混浊度时终止培养。另准备一支标准0管(含0.00ng叶酸)不接种作为0对照管。

6.4.1.5测定

将培养好的标准系列管、试样和酶空白系列管用漩涡振荡器混匀。用1cm比色杯,于nm处，以未接种0对照管调节透光率为%(或吸光度值为0),依次测定标准系列管.试样和酶空白系列管的透光率(或吸光度值)。如果0对照管出现浑浊,说明可能有杂菌污染,需重做实验。

注:适宜的测定光谱范围为nm~nm.

6.4.2微孔板法

6.4.2.1试样系列管

先将6.3试样稀释液无菌条件下用无菌水相滤膜(0.22μm)过滤除菌,取3支1.5mL无菌离心管，分别加人pL、L.μL试样稀释液.补无菌水至μL。每个梯度做2个平行。

6.4.2.2标准系列管.

按6.4.1.2中标准溶液的制备方式,体积按比例缩减至1.0mL后，在无菌条件下过滤除菌至无菌离心管中。制备2套~3套标准系列管,绘制标准曲线时,以每个标准点平均值计算。

6.4.23接种和培养.

叶酸测定培养基高压灭菌冷却后,每10mL培养基中加人菌种接种液40pL,混匀,吸取pL加人微孔板中。另吸取L标准系列管或试样系列管加人微孔板中,覆膜,混匀,置于36C士1C恒温培养箱中培养32h~40h.

6.4.2.4测定

混匀微孔板中培养物,用酶标仪在nm处测定吸光度值。

如果0对照孔出现浑浊，说明可能有杂菌污染,需重做实验。

注:适宜的测定光谱范围为nm~nm.

7分析结果表述

7.1标准曲线

以标准系列管叶酸含量为横坐标,每个标准点透光率(或吸光度值)均值为纵坐标,绘制标准曲线。

7.2试样结果计算

从标准曲线计算试样或酶空白系列管中叶酸的相应含量(c,),如果3支试样系列管中有2支叶酸.

含量在0.10ng~0.80ng范围内,且各管之间折合为每毫升试样提取液中叶酸含量的偏差小于10%,则可继续按式(1)、式(2)、式(3)进行结果计算，否则需重新取样测定.

试样稀释液的叶酸浓度按式(1)计算。

8精密度

一般食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%;营养素补充剂和强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

9其他

试管法:果蔬类试样称样量为5g时，检出限为0.2rg/g,定量限为0.4rg/g;蛋白质、淀粉含量高的试样称样量为5g时,检出限为1.0pg/g,定量限为2.0μg/g;营养强化剂和强化食品称样量为1g时,检出限为0.5pg/g,定量限为1.0ug/g.

微孔板法:添加了叶酸的样品,称样量为1.0g,稀释倍数为1时,检出限为0.5pg/g,定量限为1.0pg/g.